1. مقدمه
لاکتوپراکسیداز (Eï ، ‘1.11.1.7) آنزیمی است که در شیر پستانداران ، بزاق واشک وجود دارد .

و در شیرهای گونه های مختلف در غلظت های مختلف وجود دارد
لاکتوپراکسیداز همراه با تیوسیانات و پراکسید هیدروژن بصورت یک سیستم عمل می کند
کاتالیزاسیون پراکسیداسیون تیوسیانات به ضد میکروب قلمداد شده هیپوتیوسیانیتیون .

خاصیت ضد میکروبی لاکتوپراکسیداز به آن کاربرد بالقوه در حفاظت از شیر خام در دمای  محیطی می دهد
روش های موجود برای تخمین فعالیت پراکسیداز بر اساس دان مختلف است
اوره هایی مانند p-phenylenediamine [2] ، pyrogallol و guaiacol [4،10] ، ABTS [2،2 ‘-
azinobis- (3-اتیل بنزتیازولین-6-سولفونیک اسید)] [9 ، 10 ، 14] و بنابراین ،
مقایسه کردن دشوار است. شیمی پیچیده واکنش های پراکسیداسیون به این نیاز دارد
شرایط آزمایشی به دقت طراحی و کنترل دقیق شود تا
نرخ های اولیه خطی را بدست آورید. به طور مستقیم با غلظت پراکسیداز متناسب است.
در مطالعات جنبشی واکنشهای کاتالیزوری لاکتوپراکسیداز ، بردسلی [3] موارد ذکر شده را مشخص کرد
غلظت 1 میلی مول · L-1 ABTS ، 0.1 میلی مول-L-1 پراکسید هیدروژن و pH 5.6 به عنوان
شرایط واکنش در آزمایش ، بالاترین میزان اولیه و حداقل مهار خودکشی
برای مدت زمان 2 دقیقه با این حال ، نشان داده شده است که لاکتوپراکسیداز از نظر سطح فعال است
[8] در غلظت کم ، کاهش قابل توجهی از فعالیت آنزیم در مایع وجود دارد
فاز به دلیل جذب آنزیم در سطح ظرف ، که می تواند باشد
با قرار دادن ژلاتین در روش جلوگیری می شود [10]. با این حال ، یک مشکل عملی در وجود دارد
دستیابی به داده ها زیرا به تجهیزات زیادی نیاز دارد. بنابراین ، یک ساده و
سیستم سنجش راحت با استفاده از ABTS به عنوان بستر کروموژنیک توسط استاندارد شد
اسپکتروفتومتر توزیع و سطح لاکتوپراکسیداز در گاو و گاومیش
شیر با استفاده از این روش تعیین شد.
2. مواد و روش ها
2.1 معرف ها
2.1.1 محلول ABTS (l mmol-Lr ‘)
پنجاه و پنج میلی گرم ABTS (سیگما) در بافر فسفات حل شد (0.1 mol-L ‘:’ ، pH 6.0)
و حجم آن را به 100 میلی لیتر رساند.
2.1.2. محلول پراکسید هیدروژن (0.1 میلی مول-Lr ‘)
از محلول تجاری پراکسید هیدروژن 30٪ در هر ولت (مرک) محلول موجود
از 100 mmol-L: ‘با تیتراسیون در برابر پرمنگنات پتاسیم استاندارد تهیه شد
راه حل. محلول موجودی بلافاصله به غلظت 3.2 mmol·L-1 رقیق شد
قبل از استفاده.
2.1.3. آنزیم پراکسیداز
لاکتوپراکسیداز از شیر گاومیش به یک شاخص خلوص A4l2 / A28o = 0.94 خالص شد
[6] این ماده در غلظتهای مختلف 10 تا 800 Ilg · L-1 در فسفات حل شد
بافر نمک حاوی 0.1٪ ژلاتین (PBSG) (0.1 mol-L-l ، pH 7.0).
2.2. روش پراکسیداز
محلول ABTS (3.0 میلی لیتر) و نمونه پراکسیداز (0.1 میلی لیتر) با هم در یک اضافه شدند
کووت واکنش با اضافه شدن آغاز شد
از 0.1 میلی لیتر محلول پراکسید هیدروژن و بلافاصله اندازه گیری
جذب با استفاده از 412 نانومتر به عنوان تابعی از زمان برای 2 دقیقه در فواصل lO-s آغاز شد
اسپکتروفتومتر Spectronic 21 D (میلتون روی). اندازه گیری انجام شد
در برابر خالی معرف فقط حاوی ABTS و محلول آنزیم.
2.2.1 واحد فعالیت
یک واحد فعالیت (U) به عنوان آنزیمی که کاتالیز می کند تعریف می شود
اکسیداسیون l umol از ABTS در دقیقه در 20 “C ، در 0.1 mol-L: بافر فسفات pH 6.0 ،
با استفاده از غلظت 1 rnmol-L: “ABTS و 0.1 میلی مول-L” پراکسید هیدروژن در
مخلوط واکنش گرفتن ضریب انقراض مولی ABTS اکسید شده در 412 نانومتر
به عنوان 32400 mol-L’Lcrrr ‘[15]. هر دو در pH 6.0 و 4.4 ، فعالیت بیان شده در UmL-1
طبق پوتر و بکر محاسبه شد [11]. تغییر در جذب در 412 نانومتر x
حجم سنجش ، V (میلی لیتر) ضریب انقراض (1 میلی مول در سانتی متر “) x حجم نمونه ، v (میلی لیتر) x
زمان ، t (دقیقه) واکنش آنزیمی لاکتوپراکسیداز با ABTS به عنوان بستر طول می کشد
به صورت زیر قرار دهید: 2 ABTS + H2 O2
—> 2 ABTS + + 2 H2O
از آنجا که با تخریب 1 مول پراکسید هیدروژن ، 2 مول ABTS اکسید می شود.
بنابراین ، ضریب استوکیومتری ui = 2 در مخرج از گرفته شد
رابطه فوق. با استفاده از حجم های بالا ، می شود
~ A412 x 3.2 x 1 = 0.4938 x M41 واحد های 32.4 x 0.1 x 1 x 2
لاکتوپراکسیداز / میلی لیتر سام پای
2.3 نمونه های شیر
نمونه شیرهای ترکیبی از گاومیش های مورا و گاوهای نژاد تیره جمع آوری شد
در موسسه تحقیقات ملی لبنیات (کارنال ، هند) نگهداری می شود. نمونه ها بود
با استفاده از جداکننده کرم آلفا لاوال بدون چربی.
2.3.1. نمونه های آب پنیر
آب پنیر مایه پنیر از شیر بدون چربی با افزودن مایه پنیر Meito به میزان
20 میلی گرم در لیتر و انکوباسیون در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه. پس از تنظیم ، کشک برش داده شد
آب پنیر با استفاده از کاغذ فیلتر Whatman شماره 1 فیلتر شد. برای کشک اسید ، شیر بدون چربی
1: 1 توسط آب مقطر رقیق شد و با استفاده از 2 N HCL به pH 4.6 اسیدی شد. واضح است
آب پنیر با فیلتراسیون از طریق کاغذ فیلتر Whatman شماره 1 بدست آمد.
2.3.2. فعالیت پراکسیداز
ده نمونه از شیر کامل گاو و گاومیش ، شیر بدون چربی ، کشک پنیر و اسید
کشک پس از رقت از نظر فعالیت پراکسیداز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (1